Відгук на автореферат "Генетичний аналіз та поведінкові реакції нейродегенеративних мутантів Drosophila melanogaster"

Розділ: 

Галузь: 

Ключові слова та терміни: 

Щербакова О. В. Генетичний аналіз та поведінкові реакції мутантів Drosophila melanogaster із дегенеративними змінами в тканині мозку. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 – генетика. Інститут клітинної біології і генетичної інженерії НАН України, Київ, 2009.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Безхребетні модельні об’єкти, такі як Drosophila melanogaster, успішно використовуються для досліджень механізмів нейродегенерації і нейрональної клітинної смерті. Показано, що 75% генів, задіяних у розвитку хворіб людини, мають щонайменше одного гомолога з висококонсервативними послідовностями в дрозофіли, з них 10% - це гени, що відповідають за розвиток нейродегенерацій [Cauchi, 2006]. Більше того, виявлено високу функціональну консервативність генів людини і дрозофіли, а дегенеративні зміни мозку мух подібні до таких у хворих людей. Так, Х-зв’язана адренолейкодистрофія (XALD) – це захворювання людини [Moser et al., 1995], яке зумовлене порушеннями в метаболізмі жирних кислот, супроводжується нагромадженням жирних кислот з дуже довгими ланцюгами в мозку та наднирниках і проявляється у демієлінізації нервів і сліпоті. У пацієнтів з цим захворюванням виявлено знижену активність фермента – ацил-СоА-синтетази жирних кислот з дуже довгими ланцюгами. У дрозофіли цей фермент кодується геном bubblegum (bgm) [Min and Benzer, 1999]. Мутанти bgm проявляють дегенерацію ретини і фоторецепторних аксонів ламіни, що веде до часткової сліпоти [Kretzschmar, 2005]. Аналіз вмісту жирних кислот у цих мух показав зростання кількості жирних кислот з ланцюгами, довшими за С20. Нейродегенерація в мутантів bgm, як і у пацієнтів з XALD, пригнічується при вживанні олії Лоренцо – суміші ненасичених жирних кислот [Min and Benzer, 1999].
Подібність спостерігається і серед інших захворювань людини. Порушення функціонування білка (APPL), схожого до попередника амілоїда, гомолога людського білка, задіяного в хворобі Альцгеймера, ведуть до прогресуючої нейродегенерації дрозофіли [Cao et al., 2008]. Надмірне обгортання нейронів клітинами глії в мутантів sws супроводжує їх апоптоз [Kretzschmar et al., 1997], як і при нейропатіях людини. Багатошарові утворення в мозку мутантів eggroll є подібними до структур в мозку людей з хворобою Тея-Сакса [Min, 1997].
Отримання мутантів дрозофіли з різними фенотиповими проявами дегенерацій та характеристика генів, що беруть участь в цих процесах, сприяють ідентифікації нових генів і встановленню молекулярних механізмів, задіяних у нейродегенеративних захворюваннях людини. А оскільки дослідження по удосконаленню лікування не завжди безпечно проводити на людях, то нейродегенеративні мутанти є також зручною моделлю для аналізу ліків і компонентів їжі.
Зв’язок роботи з науковими програмами, темами, планами. Дисертаційна робота Щербакової О. В. виконана в рамках наукових досліджень, які проводилися на кафедрі генетики та біотехнології Львівського національного університету імені Івана Франка згідно тематик Міністерства освіти і науки України: «Молекулярно-генетичні механізми нейро- та міопатій при впливі ряду лікарських препаратів та генотоксикологічна оцінка дії екстремальних факторів довкілля на мінливість геномів» (№ державної реєстрації 0106U005908). Дослідження були підтримані грантом від Західно-українського біомедичного центру досліджень (WUBMRC) «Oxidative stress and nitration in neurodegeneration of Drosophila melanogaster», 2005-2006 та індивідуальним міжнародним грантом INTAS для молодих науковців «Functional analysis of new Drosophila mutants with age dependent neurodegeneration», Ref. № 05-109-5235, 2006-2007.
Мета і завдання дослідження. Метою роботи було проведення генетичного аналізу нейродегенеративних мутацій, локалізованих в третій хромосомі Drosophila melanogaster, та характеристика поведінкових реакцій нейродегенеративних мутантів. Для досягнення цієї мети були поставлені наступні завдання:
1. Отримати колекцію мутантів за третьою хромосомою із структурними змінами в мозку.
2. Провести комплементаційний аналіз одержаних мутацій, проаналізувати показники тривалості життя та динаміку появи нейродегенеративних змін у мутантів.
3. Виявити гени, мутації в яких можуть зумовлювати нейродегенерацію у досліджуваних мутантів.
4. Дослідити природу морфологічних змін в мозку нейродегенеративних мутантів D. melanogaster.
5. Проаналізувати вплив оксиду азоту та оксидативного стресу як можливих причин розвитку нейродегенерації.
6. Дослідити поведінкові характеристики мутантів.
Об’єкт дослідження. Генетичні механізми дегенеративних змін головного мозку у Drosophila melanogaster.
Предмет дослідження. Мутації, що спричиняють нейродегенерацію у мозку Drosophila melanogaster, та їхнє картування; морфологічні, функціональні та поведінкові зміни, що супроводжують нейродегенерацію.
Методи дослідження. Генетичні (індукований мутагенез, гібридологічний аналіз, комплементаційний тест, метод побудови кривих виживання), гістохімічні (виготовлення гістологічних зрізів тканини головного мозку, дослідження тканин за допомогою гістологічних барвників), імуно-гістохімічні (детекція білків у тканинах за допомогою специфічних антитіл), біохімічні (визначення активності синтази оксиду азоту, тонкошарова хроматографія ліпідів), фізіологічні (вивчення поведінкових реакцій), методи математичного аналізу отриманих результатів.
Наукова новизна одержаних результатів. У дисертаційній роботі:
- вперше ідентифіковано новий алель гена SNF4Agamma у мутантної лінії 4.14.10, який зумовлює розвиток нейродегенерації з пізнім проявом;
- вперше показано, що мутація у гені SNF4Agamma зумовлює чутливість до підвищених концентрацій кисню, за яких у мутантів 4.14.10 розвивається специфічний, не описаний раніше, нейродегенеративний фенотип;
- вперше виявлено, що мутації гена SNF4Agamma за умов підвищених концентрацій кисню здатні спричиняти порушення базальної мембрани ока, аксонів фоторецепторних клітин, дегенерацію ретини ока та ламіни мозку;
- отримано нову мутацію, 3.5.8, яка розміщена в ділянці 62В7 - 70D3 третьої хромосоми, і зумовлює відмирання нейронів шляхом апоптозу та гіперзакручування клітин глії навколо тіл нейронів.
- показано залежність розвитку нейродегенеративного фенотипу мутантів 3.5.8 від компонентів поживного середовища.
Практичне значення одержаних результатів. Одержані у дисертації результати можуть бути використані для подальших досліджень генетичних механізмів нейродегенерації. Створено колекцію нейродегенеративних мутантів D. melanogaster за третьою хромосомою, які поповнюють базу вже відомих мутацій та розширюють знання про гени, задіяні у розвитку нейродегенерації. Виявлення нової алельної форми гена SNF4Agamma, що кодує протеїнкіназу, яка активується АМФ і є негативним регулятором синтезу холестеролу, дозволяє детальніше дослідити роль метаболізму ліпідів для нормального функціонування нервової системи та розвитку нейродегенеративних захворювань, таких як хвороба Альцгеймера. Локалізація мутації 3.5.8 у ділянці 62В7-70D3 третьої хромосоми дозволяє серед генів цього району виявити гени-кандидати, які беруть участь у функціонуванні нервової системи і задіяні у нейродегенеративних процесах.
Особистий внесок здобувача. У процесі виконання дисертаційної роботи автором самостійно підготовлено огляд літератури та виконано весь обсяг експериментальних досліджень. Розробка програми вирішення завдань, аналіз та інтерпретація результатів проведені спільно з науковим керівником к.б.н., доцентом Максимів Д.В., а також з професорами Ш. Шнойлі (Stephan Schneuwly) та Алоїсом Хофбавером (Alois Hofbauer) під час стажування в університеті м.Регенсбург (Німеччина). Самостійно зібрані і підготовлені матеріали для друку у фахових наукових журналах.
Апробація результатів дисертації. Основні наукові результати дисертаційної роботи доповідались на студентських наукових конференціях (2003 – 2008 рр.) та наукових семінарах (2005, 2006, 2007, 2008) кафедри генетики та біотехнології, а також звітних наукових конференціях викладачів та співробітників біологічного факультету Львівського національного університету імені Івана Франка (2003 – 2007 рр.) та співробітників інституту зоології Регенсбурського університету (Німеччина, 2006-2007). Матеріали роботи були представлені на конференції молодих вчених з молекулярної біології і генетики (Київ, 2003), І Установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004), 42-й та 46-й наукових конференціях з досліджень на дрозофілі (Сан Дієго, 2001, 2005), І міжнародній науковій конференції студентів і аспірантів «Молодь і поступ біології» (Львів, 2005), ІІ міжнародній науковій конференції студентів і аспірантів «Молодь і поступ біології» (Львів, 2006), IV міжнародній науковій конференції студентів і аспірантів «Молодь і поступ біології» (Львів, 2008), III Міжнародній науковій конференції «Фактори експериментальної еволюції організмів» (Алушта, 2006), Міжнародній науковій конференції «Досягнення і проблеми генетики, селекції та біотехнології» (Алушта, 2007), VI Міжнародній науковій конференції «Фактори експериментальної еволюції організмів» (Алушта, 2008), 2-му з’їзді медичних генетиків (Львів 2008), 12-ій європейській конференції по вивченню нейробіології дрозофіли «Neurofly 2008» (Вюрцбург, 2008).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 17 друкованих праць, з них 7 статей в фахових виданнях та 10 тез доповідей в матеріалах з’їздів та конференцій.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів власних досліджень та їхнього обговорення, висновків, списку використаних джерел, що містить 195 найменувань. Роботу викладено на 139 сторінках машинописного тексту та проілюстровано 29 рисунками і 8 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури
В огляді літератури аналізуються сучасні уявлення про механізми нейродегенеративних процесів. Окремий розділ присвячений дослідженням по вивченню нейродегенеративних мутацій у D. melanogaster.
Матеріали та методи досліджень
Матеріалом для проведення мутагенезу служила лінія дикого типу Oregon R з ізогенізованими хромосомами. Для індукції мутацій використовували хімічний мутаген етилметансульфонат (ЕМС) у концентрації 2,5 мМ, розведений в 1% розчині глюкози, контролем слугував 1% розчин глюкози без мутагену [Ashburner, 1989].
Для виведення гомозиготних за третьою хромосомою мутантних ліній дрозофіли використали маркерну лінію Dr/Xa. Визначення рецисивного та домінантного характеру мутацій здійснювали шляхом схрещування мутантних особин з особинами лінії дикого типу. Комплементаційний аналіз було проведено, схрещуючи мутантні лінії між собою. Для картування мутації 3.5.8 використовували лінії (RDSb/TM6, Ly/TM6B), отримані з Bloomington Drosophila Stock Center (США).
Для вивчення характеру нейродегенеративних змін виготовляли парафінові [Heisenberg, 1979] та напівтонкі зрізи [Renfranz and Benzer, 1989], які аналізували за допомогою мікроскопу Laboval-3 Carl Zеiss Jena при збільшенні 15х40, а також зрізи [Renfranz and Benzer, 1989], які аналізували на електронному мікроскопі Zeiss EM 10C/VR при збільшеннях х1600, х2400, х6300. Тканину мозку для імунохімічної детекції in situ препарували методом whole-mount [Helfrich-Foerster, 2007] або виготовляли заморожені зрізи [Morante et al., 2004]. У роботі використали моноклональні первинні антитіла для виявлення активної форми каспази 3 – anti-Caspase 3 (Cell Signalling Technology), нейронів – anti-elav (Hybridoma Bank) і фоторецепторів – 22B10 (Hybridoma Bank) та вторинні антитіла Alexa 555 або bionyl anti-rat i bionyl anti-mouse. Локалізацію синтази оксиду азоту у мозку мух здійснювали тетразолієвим методом, адаптованим для тканини комах [Ott and Elphik, 2003]. Ядра ідентифікували з використанням інтеркалюючого флюорисцентного барвника DAPI (4,6-диамідино-2-феніліндол). Аналіз препаратів проводили на лазерному конфокальному мікроскопі Carl Zeiss LSM510 при збільшенні 15х40, та з використанням комп’ютерної програми Carl Zeiss LSM Image, або на мікроскопі Laboval-3 Carl Zеiss Jena при збільшенні 15х40.
На основі аналізу кривих виживання визначали показники середньої та максимальної тривалості життя [Ashburner, 1989].
Визначення кількості ліпідів проводили методом тонкошарової хроматографії [Folch et al., 1957], дані аналізували з використанням комп’ютерної програми winCATS.
Стійкість до оксидативного стресу оцінювали на основі аналізу кривих виживання та зрізів мозку мутантів, яких піддавали дії високих концентрацій кисню.
Статеву та рухову активність визначали за методами Бензера [Benzer, 1967], локомоторну поведінку – за методикою Розато [Rosato, 2007]. Фототаксичні реакції досліджували на апараті, розробленому Бензером для вивчення фототаксису [Benzer, 1967].
Для оцінки статистичної достовірності [Шпаков и Попов, 2003] обраховували середнє арифметичне (М) і стандартну похибку середнього арифметичного (m). Для оцінки достовірності різниці між статистичними характеристиками двох альтернативних сукупностей даних визначали коефіцієнт Стьюдента (t).

Результати досліджень та їх обговорення
Одержання нейродегенеративних мутантів D. melanogaster за третьою хромосомою та їхня характеристика. Для отримання нових мутацій, які б приводили до появи змін у тканині мозку, ми використали хімічний мутаген ЕМС у концентрації 2,5 мМ та одержали 16 мутантів із змінами у тканині мозку. Було виявлено, що у всіх досліджуваних лініях нейродегенерація зумовлена рецесивними мутаціями у генах третьої хромосоми. За результатами комплементаційного аналізу мутантів зі змінами у структурі головного мозку було розділено на 5 комплементаційних груп, які відрізнялись між собою фенотиповим проявом нейродегенерації. Аналіз фенотипу мозку показав, що у мутантів першої групи комплементації, яка була найчисельнішою (налічувала 6 ліній), вакуолізація мозку з‘являлась у центральних ділянках мозку і з віком поширювалася на оптичні долі. Цей фенотип був подібним до описаного у мутантів loechrig [Tschaepe et al., 2002]. У мутантів другої групи комплементації пошкодження мозку з’являлися в оптичних долях і після 20-го дня життя імаго поширювалися на центральну частину. Цей фенотип був подібним до описаного у мутанта vacu [Palladino and Hadley, 2002]. В інших групах комплементації було зафіксовао появу дрібних вакуолей по всій структурі мозку, або появу великих вакуолей в ділянках субезофагального ганглію. В особин лінії 3.5.8, яку виділили в окрему групу, спостерігалась поява вакуолей різних розмірів у всіх ділянках мозку. Слід зазначити, що у всіх ліній нейродегенерація прогресувала з віком. Провівши вивчення розвитку нейродегенерації в онтогенезі встановили, що серед отриманих мутантів є лінії 1.8.9, 5.30.2, 3.6.1 з раннім (на 5-й день) та пізнім – 3.15.6, 4.14.10 (на 20-й день) розвитком дегенерації, проте в більшості ліній дегенеративні зміни з’являлися на 10-й день.
Були побудовані криві виживання мутантних особин і лінії дикого типу Oregon (рис. 1А, Б). Порівняльний аналіз кривих виживання контрольної лінії Oregon і особин з ранньою появою мозкових змін показав, що мутанти характеризувалися зменшеною тривалістю життя та відсутністю плато або так званого періоду активної життєздатності. У особин ліній з пізнім розвитком нейродегенерації криві виживання були подібними до таких у контролі (рис. 1А). Тривалість життя особин всіх мутантних культур була на 15-40% менша, ніж у мух дикого типу.

А Б
Рис.1. Криві виживання нейродегенеративних мутантів: А. І групи комплементації з пізнім розвитком нейродегенерації, Б. ІІ, ІІІ, ІV та V груп комплементації з раннім розвитком нейродегенерації.

Наслідком нейродегенерації можуть бути зміни у поведінці. Порушення в поведінці супроводжують хворобу Паркінсона, хорею Гантінгтона та ін. [Greenspan and Dierick, 2004]. Зміни поведінкових реакцій виявлені і у нейродегенеративних мутантів дрозофіли. Так, у мутантів sniffer [Botella et al., 2003], parkin [Greene et al., 2002] та vacu [Palladino and Hadley, 2002] знижена рухова активність, що прогресує з віком. Мутація dare зумовлює порушення нюхових властивостей при навчанні [Freeman et al., 1999]. Основними поведінковими реакціями для дрозофіли є зорова, нюхова, рухова, статева, а також здатність до запам’ятовування та навчання [Greenspan, 2004]. Нами було проаналізовано рухову активність і статеву поведінку досліджуваних мутантів.
У більшості проаналізованих ліній показник статевої активності виявився близьким до значення контролю (рис. 2А). Разом з тим, були виявлені лінії зі зниженим (1.8.9, 3.15.6, 1.5.4) та підвищеним (2.9.1, 3.5.8) показником спарювання. Рухову активність ми досліджували у молодих 2-3 денних особин, коли дегенерація ще не спостерігалася, і у 20-денних особин, у яких нейродегенеративні процеси охоплювали всю тканину мозку (крім ліній з пізнім розвитком нейродегенерації). Показано (рис. 2Б), що в 2-3 денних нейродегенеративних мутантів більшості ліній показник відносної рухової активності відповідав контролю. У 20-денних нейродегенеративних мутантів майже всіх ліній зафіксоване достовірне зниження рухової активності відносно мух дикого типу, що може свідчити про вплив на поведінкові реакції поряд з процесами старіння, порушень функціонування нервової системи в результаті нейродегенеративних змін.

А
Б

До основних патологічних механізмів, які ведуть до втрати нейронів і нейродегенерації, належать окисні процеси та нітрозилювання, внаслідок дії оксиду азоту (NO) [Parathath et al., 2005]. NO синтезується синтазою оксиду азоту і бере участь у нормальних фізіологічних та патологічних реакціях організму. Патологічна дія оксиду азоту опосередковує процеси нітрозилювання білків, оксидативного стресу та ексайтотоксичності. Ми дослідили активність NOS в отриманих мутантів 2-3 денного віку, в дні появи нейродегенерацій та у 28-30 денних мух. Була виявлена група мутантів (5.30.2, 5.35.2, 3.6.1, 3.4.2, 5.36.2, 2.3.8, 1.5.4, 5.33.1), в яких активність ферменту коливалась в межах контролю і з віком зростала, виявляючи подібний з контролем профіль активності (рис.3). Відомо, що оксид азоту бере участь в біохімічних процесах при старінні організму, які не ведуть до нейродегенерацій, що спостерігається у даних ліній. В іншої групи мутантів (1.8.9, 3.15.1, 4.14.10) зафіксовано знижену активність NOS у молодих мух по відношенню до контролю, яка зростала в дні появи дегенеративних змін і при старінні знову знижувалася. Рядом дослідників показано, що подвійний нокаут генів нейрональної і ендотеліальної NOS в мишей не спричиняв порушень в структурі мозку [Huang, 2000]. Такі миші в молодому віці характеризувалися зниженою активністю ферменту, але не виявляли морфологічних відхилень від нормальних, для них також характерною була знижена тривалість життя без ознак нейродегенерації. Тому, ми припустили, що оксид азоту не впливав на розвиток нейродегенерації в цих ліній. Особливий профіль активності NOS був виявлений у лінії 3.5.8, в якої активність ферменту залишалась на рівні контролю в молодих мух та в дні появи НД, але при старінні значно знижувалась, та у лінії 2.9.1, в якої спостерігалось зростання активності NOS в дні появи нейродегенерації і різке її зниження при старінні. Зниження активності NOS в старих мух можна пояснити відмиранням нейронів, в яких функціонує NOS. Таку гіпотезу було висунуто також при дослідженні нейродегенерації у мишей [Perez Severiano et al., 2002].

З літератури відомо [Bicker, 1998], що не всі клітини мозку здатні синтезувати NO, тому ми провели гістохімічне виявлення NOS в мозку дрозофіли і відмітили інтенсивне зафарбовування кортексу оптичних долей. Виготовлення парафінових зрізів мозку допомогло локалізувати окремі клітини в медулі, в яких фіксувалося позитивне фарбування на NOS. У цій ділянці знаходяться закінчення аксонів R7/R8 фоторецепторних нейронів і можна припустити, що NO бере участь у взаємодії між цими аксонами та їх клітинами-мішенями, Гіббс [Gibbs, 2001] вказала на такий тип взаємодії у інших ділянках оптичних долей.
Оскільки важливим механізмом розвитку нейродегенерації є оксидативний стрес, ми дослідили чутливість мутантів нашої колекції до підвищених концентрацій кисню. Показники тривалості життя та фенотип тканини мозку мутантів не відрізнялись від таких у контролі. Це свідчило про те, що нейродегенеративні процеси у досліджуваних мутантів не супроводжувалися оксидативним стресом, і гени, що зумовлюють зміни в мозку, не пов’язані зі знешкодженням кисневих радикалів.
Проте в умовах гіпероксії у лінії 4.14.10 розвивався новий нейродегенеративний фенотип, який не був характерним для цього мутанта за нормальних умов: ретина ока, яка в нормі прилягає до ламіни мозку, відшаровувалася від мозку, а простір між ними заповнювався дегенеруючою тканиною (рис.4).
Дослідження нейродегенеративних процесів у мутанта 4.14.10, чутливого до оксидативного стресу. Мутація 4.14.10 попередньо була картована в ділянці делеції 93В6-93D4, де поряд із іншими розміщений ген SNF4Agamma з відомою нейродегенеративною мутацією loechrig (loe) [Tschaepe et al., 2002]. Провівши комплементаційний аналіз, ми довели алельність мутацій 4.14.10 і loe, а отже і розміщення мутації 4.14.10 у гені SNF4Agamma. Мутанти 4.14.10 і loe мають подібний фенотип дегенерації, що починається в центральній частині мозку і з віком поширюється на оптичні долі, проте нейродегенеративні зміни в loe проявляються на 7-й день життя дорослої особини, а в 4.14.10 – на 20-й. Продуктом гена SNF4Agamma [Tschaepe et al., 2002] є γ-субодиниця протеїнкінази, що активується АМФ (АМРК). АМРК є ключовим ферментом у регуляції гомеостазу клітинної енергії [Hardie, 2004]. Відомо 37 алелів даного гена, лише для мутантів loe описаний нейродегенеративний фенотип. Нами виявлено ще один алель, 4.14.10, який також зумовлює нейродегенерацію.
Для встановлення причин розвитку специфічного фенотипу в мутантів 4.14.10 за умов гіпероксії нами було проведено серію гістохімічних досліджень тканини мозку. Фарбування зрізів мозку барвником DAPI показало відсутність ядер у досліджуваній ділянці, що вказувало на відсутність цілих інтактних клітин. За допомогою антитіл до білка elav, який експресується лише в нейрональних клітинах нервової системи, відмічено зменшення кількості нейронів в кортексі ламіни після дії високих концентрацій кисню, що свідчило про їх відмирання. При фарбуванні напівтонких зрізів толуїдиновим синім спостерігалося інтенсивне забарвлення нейрональних клітин між оптичними долями і центральною частиною мозку, що вказувало на процеси клітинної смерті у них. У ділянці ламіни, в якій спостерігався специфічний фенотип після дії гіпероксії, таких клітин не було.

А Б
Рис. 4. Фенотип тканини мозку мух у ділянці ламіни після дії підвищених концентрацій кисню впродовж 6-ти днів: А. Дикий тип, Б. Мутант 4.14.10 (15х40). Стрілками показано ділянку дегенерації між оком та мозком.

З використанням методів електронної мікроскопії у мозку мутантів 4.14.10 після дії високих концентрацій кисню виявлено порушення цілісності базальної мембрани ока та вивільнення ретинальних пігментів у порожнину між оком та мозком. У контрольній лінії базальна мембрана ока щільно прилягає до мозку (рис. 5А). У тканині мозку мутантів виявлено дегенеративні зміни в будові гліальних клітин та руйнування монополярних нейронів в кортексі ламіни (рис. 5Б). Ці дані підтвердили результати фарбування тканини мозку антитілами до elav про зменшення кількості нейронів в даній ділянці мозку. Проте ознак апоптозу серед відмираючих нейронів не виявлено, що вказувало на інший шлях їх загибелі.

А Б
Рис. 5. Електронно-мікроскопічні фотографії мозку особин лінії дикого типу (А) та мутантів 4.14.10 (Б) після дії підвищених концентрацій кисню впродовж 6-ти днів (х1600). Б.м.-базальна мембрана ока, П.г.к.-порушення гліальних клітин, П.н.к.-порушення нейрональних клітин.

Оскільки було показано порушення цілісності базальної мембрани ока, ми вирішили дослідити будову очей. Око дрозофіли складається з простих елементів омматидіїв. У контрольної лінії Oregon омматидії мали правильну шестикутну форму, і в них можна було розрізнити 7 фоторецепторних клітин (рис. 6А). В мух 4.14.10 спостерігалася (рис. 6Б) дегенерація фоторецепторних клітин, яка проявлялася в утворенні вакуолей в окремих фоторецепторних клітинах та зменшенні кількості фоторецепторних клітин в межах омматидію після 6-денної гіпероксії. Також зменшувався шар пігментних клітин, які є важливими для фізичного відокремлення окремих омматидіїв та виконують трофічну функцію щодо фоторецепторів. Вакуолізація фоторецепторних клітин веде до порушення їх цілісності, що було нами доведено при фарбуванні специфічними антитілами 24В10 до білка фоторецепторів – хаоптину. За допомогою антитіл 24В10 виявлено дегенерацію та дезорганізацію R7/R8 аксонів фоторецепторних клітин у мутантів 4.14.10 внаслідок дії гіпероксії (рис. 6Г).
Порушення структури закінчень аксонів фоторецепторних клітин та вакуолізація ретини після умов гіпероксії вказували на пошкодження шляхів фототрансдукції в мутантів 4.14.10, а це, в свою чергу, могло впливати на їхню поведінку. Ми дослідили фототаксичну та локомоторну поведінку цих мутантів. Для виявлення відхилень у зорових реакціях мух ми дослідили позитивний (рух до світла) і негативний (рух від світла) фототаксис. В мух лінії Oregon позитивний фототаксис перевищував негативний, тобто переважаюча більшість особин рухалася у напрямку джерела світла. Мутанти sine oculis, які характеризувалися відсутністю очей і слугували додатковим контролем, не виявляли різниці між позитивним і негативним фототаксисом. Мухи лінії 4.14.10 уникали світла, про що свідчив знижений позитивний та підвищений негативний фототаксис (рис.7).

А Б
В Г
Рис. 6. Фенотип тканини ока та аксонів фоторецепторних нейронів після дії підвищених концентрацій кисню впродовж 6-ти днів: А., В. Особини дикого типу, Б., Г. мутанта 4.14.10. Стрілками показано вакуолізацію омматидіїв (Б) та ділянку дегенерації аксонів (Г).

Дослідження локомоторної поведінки показало в контрольних мух порушення циклічності періодів бадьорості і спокою (циркадних ритмів) після умов гіпероксії (рис.8Б). У мутантів 4.14.10 таке порушення виявлено ще за нормальних умов, а після умов гіпероксії локомоторна активність була здебільшого хаотична, без належної циклічності (рис.8Г).
Оскільки ген SNF4Agamma, в якому локалізована мутація 4.14.10, бере участь у регуляції гомеостазу холестеролу, а вільні радикали діють на ліпідні компоненти мембран, тому ми визначили вміст різних фракцій ліпідів у мух за нормальних умов та після дії високих концентрацій кисню методом тонкошарової хроматографії. В мутантів 4.14.10 спостерігався знижений вміст усіх досліджуваних ліпідних фракцій (рис. 9), а саме фосфатидилхоліну, фосфатидилінозитолу, кардіоліпіну, стеролів, жирних кислот та тригліцеридів, а після дії гіпероксії – подальше зниження концентрації фосфатидилхоліну, фосфатидилінозитолу, стеролів, жирних кислот та тригліцеридів, на 15-38% порівняно з контролем, і на 21-43% порівняно з мухами в нормальних умовах (рис.10). Знижена концентрація мембранних ліпідів в досліджуваних мутантів робить мембрани ще чутливішими до дії вільних кисневих радикалів, що виявляється у значній дегенерації мозку і ретини за умов гіпероксії.

А Б
В Г
Рис. 8. Локомоторна активність особин дикого типу та мутантів 4.14.10 впродовж 17-19 днів: А, В. За нормальних умов, Б, Г. Після 6 діб дії високих концентрацій кисню.

А Б
Рис. 9. Кількість фракцій ліпідів у мутантів: 1, 5 – мухи дикого типу в нормальних умовах; 2, 6 – мутант 4.14.10 в нормальних умовах; 3 – мухи дикого типу після дії гіпероксії; 4 – мутант 4.14.10 після дії гіпероксії. Маркери: Сквл. – сквалени, ХлПл. – Холестеринпальмітат, Тргл. – Тригліцериди, Ж-ні к-ти – жирні кислоти, Лан. – Ланостерол, Ерг. – Ергостерол, Догл. – Диолеїлгліцерол, Фгл. – L-α-фосфатидилгліцерол, Фсер. – Фосфатидил-L-серин, Фхол. – Фосфатидилхолін, Сфг. – Сфінгомієлін, ЛФХ. – L-α-Лізофосфатидилхолін.

Таким чином, новий алель гену SNF4Agamma є чутливим до оксидативного стресу і зумовлює порушення в будові нейронів і глії мозку та фоторецепторів і пігментних клітин ока. Нейродегенеративні зміни в мозку мутантів 4.14.10 супроводжуються поведінковими розладами.
Дослідження нейродегенеративних процесів у мутантів 3.5.8. Ще одним мутантом, в якого виявили інтенсивне фарбування клітин тканини мозку толуїдиновим синім, що свідчило про їх відмирання, були особини лінії 3.5.8.
Патологічні зміни у мутантів 3.5.8 з’являлися у всіх частинах мозку з 10-го дня життя імаго. Значна вакуолізація спостерігалася в ділянках нейропілю, де розміщені нейрональні відростки та тіла гліальних клітин. У ділянках кортексу ми виявили нейрони з ознаками апоптозу, а також гіперзакручування глії навколо тіл нейронів (рис. 10). Клітини глії виконують трофічну функцію щодо нейронів, утворюють бар’єр між кров’ю та мозком, виділяють речовини, які необхідні для нормального росту нейронів. Показано, що порушення гліальних функцій веде до пошкоджень аксонів та нейронального апоптозу [Kretzschmar and Pflugfelder, 2002].

А Б В
Рис. 11. Електронно-мікроскопічні фотографії зрізів мозку особин дикого типу (А) та мутанта 3.5.8 (Б, В). Стрілками відмічено гіперзакручування глії навколо нейронів (Б) та клітина з ознаками апоптозу (В).

Апоптичні зміни у мозку мутантів 3.5.8 були підтверджені фарбуванням антитілами до активної форми каспази 3, яка бере участь [Muro et al., 2006] у апоптозі впродовж ембріогенезу, у відмиранні клітин внаслідок дії радіоактивного опромінення або інгібування синтезу білків. Оскільки у особин цієї лінії була виявлена значна вакуолізація мозку в оптичних долях, ми дослідили їх поведінкові реакції і показали зниження рухової активності, позитивної фототактичної відповіді та порушення циклічності у чергуванні періодів бадьорості та спокою з віком. Зниження поведінкових реакцій в цих мутантів корелювало з прогресуванням нейродегенерації.
Мутація 3.5.8 була локалізована між маркерними генами R і D, тобто у ділянці 62В7-70D3. Аналіз цієї ділянки дозволив нам виділити гени, що можуть брати участь у розвитку нейродегенерацій: msn, sty, vn, Sod, Pdp1. Мутації в генах msn, sty, vn призводять до порушень шляхів фототрансдукції, що було характерно для лінії 3.5.8. Ген Sod кодує супероксиддисмутазу і його пошкодження ведуть до дегенерації очей і мозку. Мутанти за геном Pdp1 є чутливими до компонентів поживного середовища. Ми встановили, що у мутантів 3.5.8 додавання дріжджового екстракту сприяє підвищенню тривалості життя і затримці розвитку нейродегенеративного фенотипу. За умов росту личинок на стандартному середовищі з додаванням дріжджового екстракту нейродегенеративні зміни в мутантів 3.5.8 з’являлися після 20-го дня життя дорослої особини (порівняно з 10-м днем на стандартному середовищі), а максимальна тривалість життя становила 52,1±1,43 дні (порівняно із 42,3±2,1 днями). Ми проаналізували вплив деяких компонентів дріжджового екстракту (рибофлавіну, нікотинової та фолієвої кислоти, біотину, інозитолу, холестеролу, сахарози), проте вони не відновлювали нормального фенотипу в мутантів 3.5.8. Отже, мутація 3.5.8 локалізована у ділянці 62В7-70D3 третьої хромосоми і зумовлює відмирання нейронів шляхом апоптозу та гіперзакручування глії навколо тіл нейронів.

ВИСНОВКИ:

В результаті виконаної роботи отримано колекцію індукованих етилметансульфонатом мутантів D. melanogaster за третьою хромосомою із дегенеративними змінами в тканині мозку. Нейродегенеративні мутації мали рецесивний характер успадкування. Вони розділені на 5 груп комплементації, що відрізнялись між собою за фенотипом. Проведено генетичний та функціональний аналіз отриманих мутантів.
Основні наукові і практичні результати роботи викладено у наступних висновках:
1. Дегенеративні зміни розпочинаються як у молодих 5-ти денних особин (лінії 1.8.9, 5.30.2., 3.6.1), так і 20-ти денних імаго (4.14.10, 3.15.6). На підставі кривих виживання і аналізу показників тривалості життя встановлено кореляцію між часом виникнення дегенерації мозку і тривалістю життя особин. Максимальна тривалість життя особин мутантних ліній була на 15-40% менша, ніж у дикого типу Oregon.
2. Активність синтази оксиду азоту зростає з віком у контрольній лінії Oregon та мутантів 5.30.2, 5.35.2, 5.36.2, 5.33.1. У ліній 2.9.1, 3.5.8 виявлено відмінний профіль активності синтази оксиду азоту, порівняно з контролем: активність ферменту знижувалася при старінні.
3. Мутація 4.14.10 локалізована у гені SNF4Agamma. Мутації 4.14.10 та loe є алельними і викликають розвиток подібного дегенеративного фенотипу тканини мозку, який зумовлений порушенням метаболізму ліпідів. Умови гіпероксії в особин 4.14.10 ведуть до пошкодження сітківки ока, яка виявлялася у вакуолізації окремих фоторецепторних клітин, зменшенні кількості фоторецепторів в межах одного омматидію і шару пігментних клітин, а також до дегенерації аксонів R7/R8 фоторецепторних нейронів. У мозку цих мутантів виявляються порушення будови гліальних клітин та відмирання монополярних нейронів у ділянці ламіни.
4. Мутація 3.5.8, яка локалізована у ділянці 62В7-70D3 третьої хромосоми, призводить до відмирання нейронів шляхом апоптозу та гіперзакручування глії навколо тіл нейронів. Показано залежність розвитку нейродегенеративного фенотипу мутантів 3.5.8 від компонентів поживного середовища.
5. Виявлено лінії з низькою статевою активністю (3.15.6, 1.5.4) та статевою гіперактивністю (2.9.1, 3.5.8). Рухова поведінка знижена у всіх 20-денних мутантів (крім 4.14.10 і 3.6.1), порівняно з мухами дикого типу того ж віку. Мутанти 4.14.10 характеризуються змінами фототаксичної та локомоторної поведінки вже в молодому віці, а мутанти 3.5.8 - відхиленнями в усіх досліджуваних поведінкових реакціях в процесі старіння.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Нейродегенеративні мутанти Drosophila melanogaster: отримання, фенотипові особливості, тривалість життя / А.С. Яценко, Ю.А. Прадєд, О.В. Кисла (Щербакова), Д.В. Максимів, Г.Р. Щербата // Біополімери і клітина. – 2003. – Т. 19, №6. – С. 558 – 560. Здобувач виконала 30% експериментальних досліджень (аналіз гістологічних препаратів окремих ліній, побудова кривих виживання), брала участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні статті.
2. Щербакова О.В. Активність синтази оксиду азоту в нейродегенеративних мутантів та мух дикого типу Drosophila melanogaster / О.В. Щербакова, Д.В. Максимів, Я.І. Черник // Вісник львівського університету. Серія біологічна. – 2003. – Вип. 34. – С. 100-107. Здобувач виконала експериментальну роботу у повному обсязі, написала та оформила статтю.
3. Роль ферментів антиоксидантного захисту у процесах нейродегенерацій / О.В. Щербакова, Ю.В. Вербовицька, Д.В. Максимів, Я.І. Черник, Л.В. Степаненко, І.Й. Влох // Архів психіатрії. – 2004. – Т. 10., № 1(36). – С. 156-160. Здобувач виконала 50% експериментальних досліджень (визначила активність синтази оксиду азоту), брала участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написала та оформила статтю.
4. Вікові зміни активності каталази, супероксиддисмутази та синтази оксиду азоту в нейродегенеративних мутантів Drosophila melanogaster по 3-й хромосомі / М.М. Кучеренко, О.В. Щербакова, І.І. Ступницька, І.Я. Черник, Д.В. Максимів // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб.наук.пр. / Укр. т-во генетиків і селекціонерів ім.М.І.Вавилова. – К. Логос, 2006. – Т.3. – С. 388-391. Здобувач виконала 30% експериментальних досліджень (визначила активність та локалізацію синтази оксиду азоту в мозку мутантів), написала та оформила статтю.
5. Drosophila melanogaster – модель для молекулярно-генетичних досліджень нейро- та міопатій / Д.В. Максимів, Н.Я. Голуб, І.Б. Магорівська, І.І. Ступницька, О.В. Щербакова, Я.І. Черник // Досягнення і проблеми генетики, селекції та біотехнології: Зб.наук.пр. / Укр. т-во генетиків і селекціонерів ім.М.І.Вавилова. – К. Логос, 2007. – Т.1. – С. 269-272. Здобувач виконала 30% експериментальних досліджень (одержала частину ліній та охарактеризувала фенотип тканини мозку на парафінових зрізах), брала участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні статті.
6. Зміни у тканині мозку нейродегенеративного мутанта 4.14 Drosophila melanogaster в нормі та за умов гіпероксії / О.В. Щербакова, І.І. Могиляк, Н.П. Матійців, Д.В. Максимів, Я.І. Черник // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб.наук.пр. / Укр. т-во генетиків і селекціонерів ім.М.І.Вавилова. – К. Логос, 2008. – Т.4. – С. 339–342. Здобувач виконала експериментальну роботу у повному обсязі, написала та оформила статтю.
7. Генетический анализ нейродегенеративных мутантов Drosophila melanogaster по 3-й хромосоме, индуцированных этилметансульфонатом / Н.П. Матийцив, И.Б. Магоривская, О.В. Щербакова, Я.И. Черник, Д.В. Максимив // Генетика. – 2009. – Т.45, №2. – С. 196 – 202. Здобувач виконала 25% експериментальних досліджень (аналіз гістологічних препаратів окремих ліній), брала участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні статті.
8. Obtaining and analysis of degenerative brain mutants induced by ethylmetanesulphonate and nitrosoethylurea in Drosophila melanogaster / G.R. Shcherbata, Y.I. Chernik, Y.P Bobak, N.Y. Kimak, Y.S. Praded, O.V. Kysla (Shcherbakova), A.S. Yatsenko, D.V. Maksymiv // 42th Drosophila Research Conference. San Diego, USA, 21 – 25 March 2001. - P. 274. Здобувач брала участь у проведенні досліджень (виготовлення та аналіз зрізів мозку окремих ліній нейродегенеративних мутантів), опрацюванні та аналізі даних.
9. Analysis of degenerated brain mutants induced by ethylmetanesulphonate and nitrosoethylurea in Drosophila melanogaster / A.S. Jatsenko, O.V. Kysla (Shcherbakova), G.R. Shcherbata, D.V. Maksymiv // Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, Kyiv, 20-22 September 2001. – Kyiv, 2001. – P. 12. Здобувач брала участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі даних, написанні тез доповіді.
10. Biochemical and molecular analysis of degenerated brain mutants in Drosophila melanogaster / Shcherbakova O.V., Yatsenko A.S., Kulachkivsliy O.R., Shcherbata G.R., Maksymiv D.V. // Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, Kyiv, 25-27 September 2003. – Kyiv, 2003. – P. 31. Здобувач виконала 50% експериментальної роботи (виготовила, проаналізувала гістологічні препарати мозку та побудувала криві виживання нейродегенеративних мутантів), написала та оформила тези доповіді.
11. Нейродегенеративні мутанти Drosophila melanogaster: молекулярно-генетичний аналіз / Н. Матійців, О. Щербакова, М. Кучеренко, В. Радиш, Д. Максимів, Я. Черник // Установчий з’їзд Українського товариства клітинної біології, Львів, 25-28 квітня 2004р.: Тези доп. – Львів, 2004. – С. 303. Здобувач брала участь у проведенні досліджень (одержала частину ліній та охарактеризувала фенотип тканини мозку на парафінових зрізах), опрацюванні та аналізі даних, написанні тез доповіді.
12. Shcherbakova O. The role of nitric oxide in neurodegenerative processes in mutants of Drosophila melanogaster / O. Shcherbakova, D. Maksymiv // 46th Drosophila Research Conference. San Diego, USA, 30 March - 3 April 2005. - P. 396. Здобувач виконала експериментальну роботу у повному обсязі, написала та оформила тези доповіді.
13. Shcherbakova O. The activity of nitric oxide synthase in neurodegenerative mutants and wild-type flies of Drosophila melanogaster / O. Shcherbakova, D. Maksymiv // I Міжнародна конференція студентів та аспірантів Львів, 11-14 квітня 2005 р. – Львів, 2005. – С. 137. Здобувач виконала експериментальну роботу у повному обсязі, написала та оформила тези доповіді, представляла доповідь.
14. Щербакова О.В. Дослідження активності синтази оксиду азоту в нейродегенеративних мутантів по 3-й і 1-й хромосомах і мух дикого типу Drosophila melanogaster / О.В. Щербакова, У.М. Грицан, Д.В. Максимів // “Молодь і поступ біології”: ІІ Міжнародна конференція студентів та аспірантів. Львів, 21-24 березня 2006 р. – Львів, 2006. – С. 167. Здобувач виконала 75% експериментальної роботи (визначила активність синтази оксиду азоту у нейродегенеративних мутантів по 3-й хромосомі), написала та оформила тези доповіді, представляла доповідь.
15. Щербакова О.В. Характеристика фенотипових змін нейродегенеративного мутанта 4.14.10 в умовах оксидативного стресу / О.В. Щербакова, Д.В. Максимів // “Молодь і поступ біології”: IV Міжнародна конференція студентів та аспірантів, Львів, 7-10 квітня 2008 р.: Тези доп. – Львів, 2008.- С. 155. Здобувач виконала експериментальну роботу у повному обсязі, написала та оформила тези доповіді, представляла доповідь.
16. Functional analysis of neurodegenerative mutant 4.14.10 of Drosophila melanogaster / O. Shcherbakova, D. Maksymiv, Ya. Chernyk, S. Schneuwly // 12th European Drosophila Neurobiology Conference “Neurofly 2008”, Wuerzburg, 6-10 September 2008: Abstract – Wuerzburg, 2008. - P. 50. Здобувач виконала експериментальну роботу у повному обсязі, написала та оформила тези доповіді, представляла доповідь.
17. Щербакова О.В. Вивчення нейродегенеративних процесів на модельній системі Drosophila melanogaster / О.В. Щербакова, Д.В. Максимів, Я.І. Черник // IV з”їзд медичних генетиків України, Львів, 9-11 жовтня 2008 р.: Тези доп. – Львів, 2008. – С. 107. Здобувач виконала експериментальну роботу у повному обсязі, написала та оформила тези доповіді.

АНОТАЦІЯ
Щербакова О. В. Генетичний аналіз та поведінкові реакції мутантів Drosophila melanogaster із дегенеративними змінами в тканині мозку. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 – генетика. Інститут клітинної біології і генетичної інженерії НАН України, Київ, 2009.
У дисертаційній роботі проведено генетичний аналіз індукованих етилметансульфонатом нейродегенеративних мутацій D. melanogaster, вивчено морфологічні та функціональні зміни у тканині мозку мутантів. Отриманих мутантів було розділено на 5 груп комплементації. Особини більшості ліній характеризувалися прогресуючою з віком дегенерацією мозку, зниженими показниками середньої та максимальної тривалості життя і порушеннями у руховій та статевій поведінці. При аналізі стійкості нейродегенеративних мутантів до підвищених концентрацій кисню, виявлено мутацію 4.14.10, чутливу до оксидативного стресу, в якої нейродегенеративні зміни корелюють зі зниженим вмістом деяких фракцій ліпідів. В умовах гіпероксії у особин цієї лінії розвивався специфічний фенотип, не характерний для цих мутантів за нормальних умов. За допомогою світлової та електронної мікроскопії у мутантів 4.14.10 після дії гіпероксії відмічено відшарування ретини ока від поверхні мозку, порушення у будові тканини мозку і ока. Методом комплементаційного аналізу встановлено алельність мутації 4.14.10 з мутацією loechrig і, відповідно її розміщення у гені SNF4Agamma. При дослідженні нейродегенеративних змін у мутантів 3.5.8 показано, що відмирання нейронів у них супроводжується їх апоптозом та гіперзакручуванням глії. Мутація 3.5.8 локалізована у ділянці 62B7-70D3 третьої хромосоми. Нейродегенеративні зміни у мутантів 4.14.10 і 3.5.8 супроводжувалися порушеннями фототаксичної та локомоторної реакції.
Ключові слова: Drosophila melanogaster, нейродегенерація, старіння, поведінкові реакції.

АННОТАЦИЯ
Щербакова О.В. Генетический анализ и поведенческие реакции мутантов Drosophila melanogaster с дегенеративними изменениями в ткани мозга. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 – генетика. – Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 2009.
В диссертации проведено генетический анализ индуцированных этилметансульфонатом нейродегенеративных мутаций D. melanogaster, изучено морфологические и функциональные изменения в ткани мозга мутантов. Полученых мутантов было разделено на 5 груп комплементации. Особи линий характеризовались прогресирующей с возрастом дегенерацией мозга, снижеными показателями средней и максимальной продолжительности жизни и нарушениями в двигательном и половом поведении. Анализ стойкости нейродегенеративных мутантов к повышеным концентрациям кислорода обнаружил линию 4.14.10, чувствительную к окислительному стрессу, у которой нейродегенеративные процесы сопровождаються снижением концентраций некоторых липидов. В условиях гипероксии у особей этой линии развивался специфический фенотип, не характерный для этих мутантов в нормальних условиях. С помощью световой и электронной микроскопии у мутантов 4.14.10 отмечено отделение ретины глаза от поверхности мозга, нарушение в строении ткани мозга и глаза. Методом комплементационного анализа показана аллельность мутации 4.14.10 с мутацией loechrig и, соответствено, ее локализация в гене SNF4Agamma. При изучении нейродегенеративных изменений у мутантов 3.5.8 показано, что отмирание нейронов у них сопровождаеться их апоптозом и гиперзакручиванием глии. Мутация 3.5.8 локализирована в районе 62B7-70D3 третьей хромосомы. Нейродегенеративные изменения у мутантов 4.14.10 и 3.5.8 сопровождались нарушениями фототаксической и локомоторной реакции.
Ключевые слова: Drosophila melanogaster, нейродегенерация, старение, поведенческие реакции.

SUMMARY
Shcherbakova O.V. Genetic analysis and behavioral reactions of Drosophila melanogaster mutants with degenerative changes in brain tissue. – Manuscript.
Thesis for a Ph.D. degree on speciality 03.00.15 – genetics. – The Institute of Cell Biology and Genetic Engineering of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2009.
Neurodegenerative diseases are becoming more common as life expectancy increases. As in humans, neurodegeneration in Drosophila is generally characterized by a relatively late developmental onset, progressive deterioration of adult nervous system and high levels of neuronal apoptosis. Approximately 75% of the disease-related loci in humans have at least one homologue in flies. The fly brain is estimated to have 300,000 neurons and similarly to humans is organized into areas with separated specialized functions such as, learning, memory, olfaction and vision. Unlike humans Drosophila have a short generation time and can be maintained in large numbers in the laboratory, allowing large-scale mutagenesis and screening for neurodegenerative mutants.
This study was conducted to isolate and characterize new neurodegenerative mutants of Drosophila melanogaster, which would be valuable for identifying the key proteins and biochemical pathways responsible for neuropathology.
We have performed a saturation mutagenesis screen with ethyl methane sulphonate, obtained neurodegenerative mutants of D. melanogaster on the third chromosome and studied the morphological and functional changes in their brain tissue. Using the complementation test mutants were divided into the five groups which differed also by special degenerative phenotype. Obtained stocks were characterized by reduced mean and maximum lifespan, age-dependent neurodegeneration and behavioural deteriorations. There were stocks with decreased or increased reproductive activity and reduced moving ability. The analysis of neurodegenerative mutants’ resistance to hyperoxia treatment showed that flies 4.14.10 were sensitive to oxidative stress. These mutants exposed to hyperoxia developed an unusual phenotype that was not seen in any previously identified neurodegenerative mutants and not in mutants 4.14.10 after normal conditions. Light and electron microscopy of mutant brain tissue showed derangement of eye basal membrane, swelling of lamina ganglion cells and glia in the lamina cortex. Although the external morphology of mutant eyes appeared macroscopically normal, examination of flies after hyperoxia by light microscopy revealed vacuoles throughout retina, degeneration of receptor cells and swelling of ommatidia. Staining with 24B10 antibodies showed degeneration of the R7/R8 axons of photoreceptor cells in the medulla region of the brain. Complementation test discovered the allelism of 4.14.10 and loechrig mutations and respectively, their localization in the SNF4Agamma gene. The SNF4Agamma protein is one of the regulatory subunits of the AMP-activated protein kinase (AMPK) complex in Drosophila. AMPK is a central component of a protein kinase cascade conserved in eukaryotes that acts as a metabolic sensor to monitor the cellular AMP and ATP levels. In cases of ATP depletion, its major function described so far is to activate energy-providing mechanisms while inactivating energy-consuming processes. loechrig flies showed degeneration after 7 days of imago life, vacuolization of brain in mutant 4.14.10 appeared on the 20th day. In both lines brain pathology appeared at first in central region and spread on other parts with age. As loechrig mutants are known for derangement in cholesterol homeostasis we have measured the lipid composition in 4.14.10 mutants. After normal conditions in 4.14.10 flies were found reduced amounts of phosphatidylcholine, phospatidylinositol, cardiolipin, ergosterol and fatty acids. Thin-layer chromatography of lipids after hyperoxia showed the further reducing of their amount in mutant flies compared to control.
Detection of brain tissue of another mutant stock, 3.5.8 revealed that neurodegenerative changes in these flies appeared in all parts of the brain on the 10th day after eclosion. The electron microscopy studies revealed cells with the features of apoptosis and neurons that were enwrapped by multilayered membranes. Mutation 3.5.8 was localized in the region 62B7-70D3 of the third chromosome.
Neurodegenerations of 4.14.10 and 3.5.8 mutants were accompanied also by derangements in phototactic and locomotor behavior.
Obtained mutants of D. melanogaster are useful models for studying the neurodegenerative processes and can be used for further researches on identification the mechanisms and genes that are involved in neurodegeneration.
Key words: Drosophila melanogaster, neurodegeneration, aging, behavior.

Робота виконана на кафедрі генетики та біотехнології
Львівського національного університету імені Івана Франка
Відгуки можна висилати туди ж, за адресою:
Львівський національний університет ім.І.Франка
Біологічний факультет, кафедра генетики та біотехнології,
вул. Грушевського, 4, м. Львів, 79005